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Título: Immune expression and inhibition of heat shock protein 90 in uveal melanoma
Autores: Faingold, Dana
Fecha: 2010
Publicador: McGill University - MCGILL
Fuente:
Tipo: Electronic Thesis or Dissertation
Tema: Health Sciences - Pathology
Descripción: Uveal melanoma (UM) is the most common intraocular tumor in adults. Despite the increase in diagnostic accuracy over the past several decades and the development of eye saving treatments such as plaque radiotherapy and photon beam therapy, there was no significant change in the prognosis in uveal melanoma due to metastatic disease. Therefore, we started to search for novel therapeutic targets in UM, such as heat shock protein 90 (Hsp90). This protein is a chaperone for several proteins (clients) involved in signal transduction and cell cycle control like kinases and transcription factors and plays a key role in regulating their stability and function. Hsp90 is expressed by a variety of tumor types and its inhibition results in the down regulation and proteasomal degradation of its client proteins.
The objective of this study was to examine the immunohistochemical profile of Hsp90 and its association with prognostic features in uveal melanoma. In addition, we studied the role of Hsp90 in promoting growth and survival of uveal melanoma and the molecular consequences of inhibiting Hsp90 function by the small-molecule 17-allylamino-17-demethoxy-geldanamycin (17-AAG).
Hsp90 expression was studied in five primary human uveal melanoma cell lines by Western blot analysis and immunofluorescence methods in 44 specimens of human UM, 14 specimens from an animal model of UM and also in metastatic specimens.
In addition we determined the cytotoxicity profile of five primary UM cell lines and one metastatic derived cell line (OMM-1.5) after exposure to Hsp90 inhibitor 17-AAG. Sulfurhodamine-B based proliferation assay was used to compare UM cell growth with a range of concentrations of 17-AAG. Changes in cell migration and invasion and apoptosis and cell cycle assays were evaluated by flow cytometry. The expression of intracellular proteins was determined using Western blot analysis.
Hsp90 was identified in 68 % of cases of primary uveal melanoma and was expressed in 87% of metastatic specimens. The expression of the Hsp90 in primary tumor was significantly associated with largest tumor dimension.
Inhibition of Hsp90 function by 17-AAG caused a dose-dependent growth inhibition of primary and metastatic UM cell lines. 17-AAG induced cytostasis which was associated with a decrease in cyclin-dependent kinase CDK4. Also, 17-AAG induced apoptosis with a significant increase in caspase 3-protease activity after drug exposure. The cytotoxic effect of 17-AAG was associated with decreased levels of Akt and phospho-Akt after 24 h exposure to the drug. 17-AAG significantly reduced the migratory and invasive capabilities of all 5 uveal melanoma cell lines. 17-AAG down regulated c-Met and IGF-1R receptor transmembrane tyrosine kinases and also inhibited activation of focal adhesion kinase (FAK).
For the first time in UM, we demonstrate that over expression of Hsp90 in patients is linked to an indicator of poor prognosis. To the best of our knowledge, this is the first report showing the effect of Hsp90 inhibitor 17-AAG, on proliferation of UM cells which induced cell cycle arrest and apoptosis. Downregulation of p-Akt in response to Hsp90 inhibition could represent one possible mechanism of mod-ulation of the phosphatidylinositol 3'-kinase (PI3K)-Akt pathway in uveal melanoma. Also, we demonstrated for the first time that inhibition of Hsp90 function had an effect on UM cells motility and invasive potential and in cellular processes involved in metastasis in uveal melanoma. This data indicates that UM is a suitable target for modulation of Hsp90 activity and that Hsp90 inhibitors are possible therapeutic modalities for UM patients. Prospective studies are needed to confirm the prognostic role of Hsp90 in UM and further trials in uveal melanoma models should be undertaken to study the effect of inhibition of Hsp90 in vivo.
Le mélanome uvéal (UM) est la tumeur intraoculaire primitive la plus fréquente chez les adultes. Par conséquent, nous avons commencé à la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques dans l'UM, tels que les protéines de choc thermique 90 (Hsp90). Hsp90 est une protéine chaperon indispensable à l'activation et la régulation d'un ensemble important de protéines de la signalisation et de la régulation cellulaire. L'utilisation d'inhibiteur spécifique de Hsp90 entraîne une baisse de l'activité des protéines clientes.
L'objectif de cette étude était d'examiner le profil des Hsp90 et son association avec les caractéristiques pronostiques dans mélanome de l'uvée. En outre, nous avons étudié le rôle qu'elle joue dans les mécanismes cellulaires de prolifération de mélanome de l'uvée et les conséquences de l'inhibition de la fonction de Hsp90 par 17-allylamino-17-demethoxy-geldanamycin (17-AAG).
L'expression immunohistochimique des Hsp90 a été étudiée dans cinq lignées de cellules tumorales in-vitro par Western blot et méthodes d'immunofluorescence. L'expression de Hsp90 a été évaluée dans 44 spécimens l'UM humaine et 14 spécimens d'un modèle animal de l'UM et dans des spécimens provenant de lésions métastatiques humaines et animales. En outre, notre étude a visé à comparer les effets antiprolifératifs du 17-AAG sur les lignées cellulaire cancéreuse d'UM humaine et dans une lignée de cellules tumorales dérivées d'une lésion métastatique (OMM-1,5). La prolifération cellulaire a été évaluée par le test à la sulforhodamine B sur les cellules exposées à une gamme de concentrations de 17-AAG.
Les changements dans la migration et l'invasion cellulaire en présence ou l'absence de la 17-AAG. Le processus apoptotique et les fractions de cycle cellulaire ont été déterminés par cytométrie en flux. Analyse de l'expression de Hsp90 et l'expression de protéines intracellulaires a été déterminée par l'analyse Western blot.
L'expression des Hsp90 a été identifiée dans 68% des spécimens et a été exprimée dans 87 % des spécimens métastatique. L'expression de l'Hsp90 dans la tumeur primaire a été significativement associée à la plus grande dimension de la tumeur.
L'inhibition de la fonction Hsp90 par 17-AAG a entraîné une inhibition de croissance dose-dépendante avec une réduction statistiquement significative. 17-AAG induit arrêt du cycle cellulaire qui a été associée à une diminution de la kinase CDK4. En outre, 17-AAG induisent l'apoptose dans les cellules d'UM et une augmentation de l'activité de la caspase-3. L'effet cytotoxique de la 17-AAG a été associé à une baisse des niveaux d'Akt et phospho-Akt, 24 h après l'exposition à la drogue.
L'exposition à la 17-AAG a considérablement réduit les capacités migratoires et invasives des les cinq lignées de cellules d'UM et provoquent une baisse des niveaux de récepteurs tyrosine kinases transmembranaires c-Met et IGF-1R et aussi a également réduit l'expression de la kinase d'adhérence focale (FAK).
Pour la première fois en UM nous démontrer que l'expression de Hsp90 chez des patients est liée à un indicateur de pronostic défavorable. Nos résultats apportent des informations originales sur les effets cytotoxiques de 17-AAG sur la prolifération des cellules d'UM qui induit un arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose. Le diminution de p-Akt en réponse à Hsp90 inhibition pourrait constituer un mécanisme possible de la modulation de la phosphatidylinositol 3'-kinase (PI3K) - Akt signalisation de mélanome de l'uvée.
L'expression de Hsp90 dans métastases et l'évaluation des processus cellulaires impliqués dans l'invasion après l'inhibition de la fonction de Hsp90 suggéré l'utilité des inhibiteurs de Hsp90 dans la prévention de la progression tumorale et les métastases. L'ensemble de nos résultats montre que le ciblage Hsp90 mai constituer une nouvelle approche thérapeutique pour les patients avec le mélanome de l'uvée.
Idioma: en