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Título: Interactions between energy transducer TonB and ferric hydroxamate transport proteins from «Escherichia coli»
Autores: Carter, David
Fecha: 2010
Publicador: McGill University - MCGILL
Fuente:
Tipo: Electronic Thesis or Dissertation
Tema: Biology - Microbiology
Descripción: The ferric hydroxamate uptake (Fhu) system of Escherichia coli transports ferric hydroxamate-type siderophores. This system comprises outer membrane (OM) receptor FhuA, periplasmic binding protein FhuD, and ABC permease FhuB/C. In addition, transport through FhuA requires energy input provided by the cytoplasmic membrane (CM)-embedded TonB/ExbB/ExbD multi-protein complex.
This thesis focuses on identification and characterization of protein-protein interactions that facilitate siderophore transport. Phage display technology predicted protein-protein interactions involved in TonB-dependent transport; peptide motifs predicted to bind TonB were identified from phage panning experiments using purified TonB. Peptide sequences that were displayed on TonB-interacting phage were similar to sequences of periplasm-exposed regions on FhuA and therefore predicted FhuA regions that TonB might bind to. Binding to these regions was confirmed by ELISA; predicted TonB-binding sequences were fused to maltose-binding protein (MBP) and binding to TonB was confirmed by immunoreactivity towards monoclonal antibodies directed against MBP.
TonB was also found to bind FhuD. Peptide sequences displayed on TonB-binding phage identified regions within FhuD to which TonB was predicted to bind. Furthermore, phage panning experiments against purified FhuD predicted complementary regions on TonB that FhuD was predicted to bind. Binding between TonB and FhuD was confirmed in vitro. Accordingly, biophysical methods confirmed that TonB and FhuD formed a 1:1 siderophore-independent complex with an affinity (KD) ranging from 20-200 nM.
Further analyses demonstrated that regions proximal to TonB's C-terminus were essential for interaction with FhuD. Binding was characterized between FhuD and three periplasmic TonB derivatives: a derivative possessing residues 33-239, a derivative with a deletion of TonB's central proline-rich region, and a derivative possessing residues 103-239. Surface plasmon resonance technology confirmed that all derivatives bound FhuD in concentration-dependent manners with similar low nanomolar affinities. TonB-derived oligopeptides that were predicted to bind FhuD were computationally docked to a FhuD crystal structure. Docking solutions suggested that, when bound to TonB in vivo, FhuD's siderophore binding site would orient towards the OM where it could bind siderophore as it emerges from FhuA's lumen during transport. These findings increase our knowledge of TonB-dependent transport by delineating regions of interaction between protein partners of a siderophore transport system.
Le transport des sidérophores de type hydroxamique de la bactérie Escherichia coli est effectué par le système d'acquisition du fer hydroxamique (Fhu) qui comprend FhuA, le récepteur de la membrane externe, FhuD, une protéine périplasmique de liaison et FhuB/C, une perméase de type ABC. De plus, pour effectuer le transport, FhuA requiert de l'énergie qui lui est fournie par le complexe de protéines TonB/ExbB/ExbD situé dans la membrane cytoplasmique.
Cette thèse se concentre sur l'identification et la caractérisation des intéractions protéine-protéine impliquées dans le transport des sidérophores. La technique de phage display, en déterminant des motifs peptidiques qui se lient à la protéine TonB, a permis d'identifier des intéractions protéine-protéine impliquées dans le transport TonB-dépendant. Les séquences peptidiques de phage qui se sont liées à la protéine TonB correspondent à des régions de FhuA exposées au périplasme, ce qui permet d'avancer que les deux protéines entrent en contact en ces endroits. Pour confirmer ces résultats, les séquences peptidiques présumées se lier à TonB ont été fusionnées à la protéine de liaison du maltose (MBP) pour être testées contre TonB par ELISA. L'immunoréaction de ces constructions avec des anticorps monoclonaux contre MBP ont permis de confirmer ces intéractions.
TonB se lie aussi à FhuD. La séquence peptidique des phages qui ont liés TonB correspond à certaines régions de la protéine FhuD. De plus, l'utilisation de phage display contre FhuD a permis de déterminer une autre série de séquences peptidiques qui correspondent à la protéine TonB. Ensemble, ces deux séries de séquences peptidiques identifient des sites d'intéractions complémentaires entre FhuD et TonB. Des méthodes biophysiques ont permis de confirmer l'intéraction entre TonB et FhuD in vitro. Celles-ci montrent la formation d'un complexe ayant une stoechiométrie de liaison de 1:1 ayant une affinité (KD) se situant entre 20 et 200 mM et qui est indépendante de la présence d'un sidérophore.
Des analyses plus poussées ont permis de démontrer que la région la plus proche de l'extrémité carboxy-terminale de TonB était essentielle pour l'intéraction avec FhuD. Les caractéristiques de liaison entre FhuD et trois différentes constructions de TonB ont été étudiées: une construction incluant les acides aminés 33 à 239, une construction dénuée de la partie centrale riche en proline et une construction comprenant les acides aminés 103 à 239. La technique de résonance plasmonique de surface (SPR) a permis de confirmer l'intéraction entre FhuD et les trois différentes constructions comme étant dépendante de leur concentration et ayant un niveau d'affinité similaire d'ordre nanomolaire.
L'intéraction entre FhuD et les séquences de peptides de TonB prédites a été étudié par simulation informatique d'ancrage avec la structure cristalline de FhuD. Les résultats obtenus suggèrent que lorsque FhuD se lie à TonB in vivo, il se positionne de façon à ce que le site de liaison du sidérophore s'oriente vers la membrane externe, d'où il pourrait se lier avec le sidérophore dès que celui-ci quitte la cavité de FhuA. Ces résultats améliorent notre compréhension du transport TonB-dépendant en cernant plus précisément les régions d'intéraction entre les différentes protéines impliquées dans l'acquisition des sidérophores.
Idioma: en