1. Inicio
  2. Atrás
Título: Development of an «In Vivo» eIF4E-RNA immunoprecipitation assay
Autores: Kreps, Amina
Fecha: 2014
Publicador: McGill University - MCGILL
Fuente:
Tipo: Electronic Thesis or Dissertation
Tema: Biology - Molecular
Descripción: Although eIF4E plays an important role in the development and progression of cancer, the mechanism through which it acts has not been directly characterised. In order to aid in the progression of this knowledge, an in vivo eIF4E-mRNA immunoprecipitation assay was developed and validated in NIH 3T3 cells. This assay demonstrates its ability to specifically pull down capped mRNAs bound to ectopically expressed 3X-FLAG tagged eIF4E. Mutations in eIF4E that affected cap binding and/or interaction with eIF4G or 4E-BP were also evaluated for their RNA binding potential. Elution of mRNAs from eIF4E with m7GTP competition was not observed following cell lysis, indicating that post-lysis association did not affect the immunoprecipitated mRNA pool. Our assay was able to document small molecule inhibition of eIF4E activity in cells ex vivo. The assay demonstrated a significant, reproducible decrease in mRNA binding following treatment with mTOR kinase inhibitor PP242, and will be useful in the evaluation of the eIF4E-interactome as well as assessing small molecule inhibitors of eIF4E-cap interaction.
Bien que le facteur de traduction eIF4E joue un rôle important dans le développement et la progression des cellules cancéreuses, le mécanisme avec lequel il y participe reste encore très méconnu. Afin d'aider à élucider ce rôle, nous avons développé une méthode d'immunoprécipitation vérifiant l'interaction entre eIF4E et les ARNm in vivo à partir de cellules NIH 3T3. Cette méthode permet l'isolement spécifique des ARNm qui sont liés à la protéine eIF4E exprimée de manière ectopique et qui contient une séquence 3X-FLAG. Le mutant eIF4E-W56A, qui empêche la liaison de la protéine au cap, le mutant G139D, qui bloque son interaction à eIF4G ou 4E-BP, ainsi qu'un double mutant ont été utilisés afin de valider la méthode. Notre méthode à permis de démontrer que l'ajout de composés bloquant l'interaction entre eIF4E et les ARNm induit une perte significative d'ARNm recouvré suite à la purification. Par contre, nous n'avons pas observé de pertes d'ARNm lorsque nous avons ajouté le compétiteur de la liaison au cap, le m7GTP, suite à la lyse cellulaire, indiquant que l'interaction potentielle entre eIF4E et les ARNm qui pourrait avoir lieu suite à la lyse est négligeable. De plus, nous avons démontré en utilisant notre méthode qu'une diminution reproductible dans la liaison d'eIF4E aux ARNm est détectée en utilisant l'inhibiteur de la kinase mTOR PP242. Cet inhibiteur, ainsi que les composés qui bloquent l'interaction entre eIF4E et les ARNm seront maintenant utilisés afin d'évaluer la totalité de l'interactome entre eIF4E et les ARNm cellulaires.
Idioma: en