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Título: Regulation of the guanine nucleotide exchange activity in the connecdenn/DENND1 family of proteins
Autores: Nossova, Nadejda
Fecha: 2014
Publicador: McGill University - MCGILL
Fuente:
Tipo: Electronic Thesis or Dissertation
Tema: Biology - Neuroscience
Descripción: The Rab superfamily of small GTPases coordinates essentially every step of vesicle trafficking starting from vesicle formation, followed by transport and eventually fusion with the target membrane. Rab proteins are able to regulate such a large range of functions by cycling between active, GTP-bound and inactive, GDP-bound forms. In their active form Rabs recruit effector proteins that mediate their downstream functions. Guanine nucleotide exchange factors (GEFs) activate Rabs by catalyzing the removal of GDP and GTPase activating proteins turn off Rabs by enhancing the intrinsic rate of Rab GTP hydrolysis. DENN-domain proteins form the single largest class of Rab GEFs with 26 members identified to date. The catalytic GEF activity of the isolated DENN domain was first demonstrated in DENND1A/connecdenn 1 (CD1) towards Rab35. The connecdenn subfamily contains three proteins, CD1-3, that all exhibit GEF activity towards Rab35. The general objective of this Masters project was to identify mechanisms that regulate the enzymatic activity of the CD family of GEF proteins. A common mechanism of GEF protein regulation is autoinhibition of the catalytic domain by an intramolecular interaction. We demonstrated that the GEF activity of purified, full length CD proteins is lower than the GEF activity of the purified, isolated DENN domains. This indicates an intramolecular interaction where an inhibitory motif in the C-terminal region interacts with the DENN domain and suppresses the enzymatic activity. We also found that all three CD proteins are phosphorylated outside their DENN domains on serine and threonine residues. In CD1, phosphorylation leads to reduced Rab35 binding, which implies lower catalytic activity. In addition, we established that CD1 interacts with 14-3-3 proteins in a phosphorylation-dependent manner. CD1 contains two separate 14-3-3 binding sites within the C-terminal region; however, the functional outcome of 14-3-3 binding remains unknown. Overall, our work describes regulation of GEF activity of the CD family by an intramolecular interaction and phosphorylation. As phosphorylation decreases substrate binding and GEF activity, we propose that phosphorylation of CD proteins occurs upstream of Rab35 inactivation and provides a link between cell signaling cascades and Rab35-mediated transport. Together, our insights contribute to the general knowledge about regulation of GEF proteins and downstream membrane trafficking events.
Les petites GTPases de la famille Rab régulent les différentes étapes du trafic vésiculaire telles que la formation des vésicules, leur transport, ou encore leur fusion avec la membrane du compartiment accepteur. Les protéines Rab contrôlent de nombreuses fonctions au sein des cellules et existent sous deux états : un état actif, dans lequel elles sont chargées en GTP, et un état inactif, dans lequel elles sont chargées en GDP. Dans leur état actif, les protéines Rab recrutent leurs effecteurs qui régulent diverses fonctions cellulaires en aval. Les facteurs d'échange de nucléotide guanine (GEF) activent les protéines Rab en catalysant l'échange du GDP en GTP alors que l'hydrolyse du GTP par les protéines activatrices de l'activité GTPase (GAP) détermine le passage des protéines Rab de l'état actif à l'état inactif.Avec 26 membres identifiés à ce jour, les protéines à domaine DENN constituent la plus grande famille de GEF pour les protéines Rab. L'activité catalytique GEF des domaines DENN a été mise en évidence pour la première fois pour le domaine DENN de la protéine DENND1A/connecdenn 1 (CD1), qui a une activité GEF pour Rab35. Il a depuis été démontré que les trois protéines de la famille des connecdenn, connecdenn 1 à 3, présentent toutes une activité GEF pour Rab35. L'objectif général de ce projet de maîtrise était d'identifier les mécanismes régulant l'activité enzymatique GEF des protéines de la famille connecdenn.L'autoinhibiton de leur domaine catalytique par une interaction intramoléculaire est un mécanisme courant de régulation de l'activité GEF des protéines. Nous avons démontré que l'activité GEF des protéines connecdenn entières purifiées est plus faible que celle de leurs domaines DENN respectifs, démontrant ainsi l'existence d'une interaction intramoléculaire au sein de la protéine. En effet, un domaine inhibiteur situé dans la région C-terminale de la protéine interagit avec le domaine DENN pour en supprimer l'activité enzymatique. Nous avons également mis en évidence que les trois protéines connecdenn sont phosphorylées sur des résidus serine et thréonine, en dehors de leur domaine DENN. La phosphorylation de connecdenn 1 diminue son affinité pour Rab35 reflétant ainsi une diminution de son activité catalytique. De plus, connecdenn 1 possède deux domaines d'interaction avec les protéines 14-3-3 et seule la forme phosphorylée de connecdenn 1 interagit avec les protéines 14-3-3. Cependant, la signification fonctionnelle de cette interaction demeure inconnue. Globalement cette étude décrit la manière dont l'état de phosphorylation des protéines de la famille connecdenn et l'existence d'une interaction intramoléculaire régulent leur activité GEF. Ce travail contribue ainsi à une meilleure compréhension de la régulation des protéines GEF en général, mais aussi de la régulation des voies de trafic membranaire dans lesquelles elles sont impliquées.
Idioma: en