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Título: Role of PP2A in cell death induced by the adenoviral protein E4orf4
Autores: Mui, Melissa
Fecha: 2012
Publicador: McGill University - MCGILL
Fuente:
Tipo: Electronic Thesis or Dissertation
Tema: Biology - Molecular
Descripción: The E4orf4 protein of adenovirus induces cell death in human cancer cells and not normal primary cells when expressed alone. E4orf4 is also lethal to the yeast Saccharomyces cerevisiae, which we use as a model system. E4orf4-induced toxicity in both mammalian and yeast cells is largely dependent on its ability to associate with protein phosphatase 2A (PP2A), a highly conserved Ser/Thr phosphatase, more specifically, with the B class of regulatory subunits, of which Bα is best characterized in mammalian cells, as well as the yeast equivalent Cdc55. Binding to the B subunit appears to inhibit PP2A activity with some substrates. Consequently, E4orf4 is a useful agent in delineating specific functions of Bα/Cdc55-containing PP2A holoenzymes in vivo. E4orf4 induces mitotic arrest, suggesting that PP2ACdc55 plays a role in regulating mitotic exit. The Anaphase Promoting Complex/Cyclosome (APC/C) is a multi-subunit complex involved in the timely degradation of cell cycle proteins to allow the mitotic exit of cells. Two forms of the APC, APCCdc20 and APCCdh1, control mitotic transitions and we demonstrate that E4orf4, through its interaction with Cdc55, induces unscheduled APCCdc20 activity in S-phase arrested cells, and results in the untimely degradation of both Pds1/securin and the cohesin Scc1. In contrast, E4orf4 prevents induction of APCCdh1. Thus, E4orf4 may uncouple PP2ACdc55 regulation of mitotic events. While the specific mechanism by which E4orf4 mediates cell death is unclear, its interaction with the B regulatory PP2A subunit plays a significant role. Cdc55 and Bα contain seven WD40 repeats organized into a seven-bladed propeller structure. In an attempt to functionally map the Cdc55 subunit, we identified regions in Cdc55 required for E4orf4 binding. A polypeptide composed only of blades 1 and 2 bound to E4orf4, and overexpression of this fragment blocked E4orf4 toxicity in yeast. Later on, with the knowledge of the Bα crystal structure, we delineated the precise regions of Bα/Cdc55 involved in E4orf4 binding. Mutational studies in both yeast Cdc55 and mammalian Bα suggest that E4orf4 binds across the substrate-binding groove of the B regulatory subunits, and binding interferes with the interaction of certain substrates, such as p107, with the PP2A holoenzyme. This deregulation of PP2A activity by E4orf4 may affect the functions of certain critical substrates, ultimately leading to cell death.
La protéine adénovirale E4orf4 induit la mort cellulaire dans les cellules cancéreuses humaines et non dans les cellules normales primaires lorsqu'elle est exprimée seule. E4orf4 est également létale dans la levure Saccharomyces cerevisiae, que nous utilisons comme modèle. La toxicité induite par E4orf4 dans les cellules de mammifères et dans la levure dépend largement de son association avec la phosphatase protéique 2A (PP2A), une Ser/Thr phosphatase hautement conservée. Plus spécifiquement, E4orf4 s'associe avec les sous-unités régulatrices de classe B, parmi lesquelles Bα, la mieux caractérisée dans les cellules de mammifères, et Cdc55, son équivalent chez la levure. Il semble que la liaison avec la sous-unité B inhibe l'activité de PP2A pour certains substrats. En conséquence, E4orf4 est un outil très utile pour définir les fonctions spécifiques de l'holoenzyme PP2A contenant Bα/Cdc55 in vitro. E4orf4 induit un arrêt mitotique, ce qui suggère que PP2ACdc55 joue un rôle en régulant la sortie de mitose. Le complexe APC/C (Anaphase Promoting Complex/Cyclosome) est un complexe de plusieurs sous-unités impliqué dans la dégradation minutée des protéines du cycle cellulaire, permettant ainsi aux cellules de sortir de mitose. Deux formes de l'APC/C, APCCdc20 et APCCdh1, contrôlent les passages mitotiques et nous avons démontré qu'E4orf4, par son interaction avec Cdc55, induit une activité non programmée d'APCCdc20 dans les cellules arrêtées en phase S, ce qui résulte en une dégradation désynchronisée de Pds1/securin et de la cohésine Scc1, alors qu'au contraire, E4orf4 prévient l'induction d'APCCdh1. Il semble donc qu'E4orf4 soit responsable du découplage de la régulation, par PP2ACdc55, des évènements mitotiques. Bien que le mécanisme spécifique par lequel E4orf4 régule la mort cellulaire reste incertain, son interaction avec la sous-unité régulatrice B de PP2A joue un rôle important. Cdc55 et Bα contiennent sept répétitions WD40, organisées dans une structure en hélice à sept pales. Dans le but de cartographié fonctionnellement la sous-unité Cdc55, nous avons identifiés les régions de Cdc55 qui sont nécessaire pour la liaison avec E4orf4. Un polypeptide composé uniquement des pales 1 et 2 est toujours capable de se lier à E4orf4, et la surexpression de ce fragment bloque la toxicité d'E4orf4 dans la levure. Plus tard, avec la résolution de la structure cristalline de Bα, nous avons délimité les régions précises de Bα/Cdc55 impliquées dans la liaison avec E4orf4. Des études mutationnelles réalisées à la fois dans Cdc55 (levure) et dans Bα (mammifère) suggèrent qu'E4orf4 se lie aux sous-unités régulatrices B au travers de la zone de liaison du substrat, et que cette interaction interfère avec la liaison de certains substrats, tels que p107, avec l'holoenzyme. Cette dérégulation de l'activité de PP2A par E4orf4 pourrait affecter les fonctions de certains substrats vitaux, ouvrant ainsi la voie vers la mort cellulaire.
Idioma: en