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Título: Protein folding cooperativity and functional dynamics
Autores: Farber, Patrick James
Fecha: 2011
Publicador: McGill University - MCGILL
Fuente:
Tipo: Electronic Thesis or Dissertation
Tema: Chemistry - Biochemistry
Descripción: The research reported in this Thesis has contributed to the development of methodologies in the study of disorder-to-order transitions, as well as given insight into the thermodynamics and kinetics of specific, biologically relevant processes in a small DNA binding protein, PBX homeodomain through a combination of Nuclear Magnetic Resonance (NMR) dynamics experiments and Differential Scanning Calorimetry (DSC). The major conclusions and contributions to original knowledge from each chapter are outlined below. A model is presented where protein folding kinetic data for multiple mutations at individual hydrophobic core positions can be well accounted for by two parameters describing the dependence of transition state stability on both native-like interactions (both specific packing and hydrophobic burial) and additional (non-native) hydrophobic collapse,. The two-parameter fits represent a general approach for interpreting folding data for multiple mutations at hydrophobic core positions and provide more detailed information on the structure of the transition state than do existing methods.A combination of DSC, NMR thermal melt, and CPMG experiments were used to determine whether PBX homeodomain (PBX-HD, residues 1-59) crosses an energy barrier upon folding. It was shown that PBX-HD folds rapidly (kF = 4090 s-1 at 25 °C) over a single, entropic energy barrier. A novel global analysis of DSC, NMR thermal melt and CPMG experiments was developed which provides a robust approach for analyzing folding cooperativity. A combination of 15N NMR relaxation dispersion experiments and DSC were used to examine the nature of millisecond timescale motions in the PBX homeodomain (PBX-HD, residues 1-78). Residues in the TALE (three amino acid loop extension), DNA binding region, and C-terminal extension of PBX-HD undergo concerted conformational transitions. These three regions of the protein are known to communicate allosterically, and this study shows that these regions are energetically linked.Finally, the backbone flexibility of PBX (residues 1-78) was investigated through NMR relaxation experiments. A series of four relaxation experiments that provide an exchange-free measure of dipole-dipole 15N transverse relaxation were employed. Somewhat surprisingly, relaxation experiments show that helix 1 is highly flexible on the picosecond timescale. This gives support to the proposed stabilizing role of the disorder-to-helix conformational transition of the C-terminal extension.
La recherche présentée dans cette thèse a contribué au développement de méthodologies dans l'étude des transitions de désordre-à-ordre, ainsi que donner un aperçu de la thermodynamique et cinétique des processus spécifiques, biologiquement pertinentes dans une petite protéine de liaison de l'ADN, l'homéodomaine PBX, via une combinaison d'expériences de dynamiques par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) et de Calorimétrie Différentielle à Balayage (DSC). Un modèle est présenté dans lequel des données cinétiques de repliement de protéine pour de multiples mutations fait à des positions spécifiques dans le cœur hydrophobe peuvent être bien représentées par deux paramètres décrivant la dépendance de la stabilité de l'état de transition sur les deux interactions natives (à la fois d'emballage spécifique et de formation de coeurs hydrophobes) et sur (non-natives) les effondrements hydrophobes additionnelles. Le modèle à deux paramètres représentent une approche générale pour l'interprétation des données de repliement de protéine pour de multiples mutations à des positions spécifiques dans le cœur hydrophobe et fourni des informations plus détaillées sur la structure de l'état de transition que les méthodes existantes. Une combinaison d'expériences de DSC, de fusion thermique par RMN, et de CPMG a été utilisée pour déterminer si l'homéodomaine PBX (PBX-HD, résidus 1-59) traverse une barrière énergétique lors du repliage. Il a été démontré que PBX-HD se replis rapidement (kF = 4090 s-1 à 25 ° C) en traversant une seule barrière entropique d'énergie. Une nouvelle analyse globale des expériences de DSC, de fusion thermique par RMN et de CPMG a été élaborée qui fourni une approche robuste pour l'analyse de la coopérativité de repliage. Une combinaison d'expériences de la dispersion de 15N due à la relaxation par RMN et de DSC a été utilisée pour examiner la nature des mouvements à l'échelle des millisecondes dans l'homéodomaine PBX (PBX-HD, résidus 1-78). Les résidus situés dans le TALE (three amino acid loop extension), région de liaison d'ADN, et l'extension terminale C de PBX-HD subissent des transitions de changement de conformations concerté. Ces trois régions de la protéine sont connues pour communiquer de façon allostérique, et cette étude démontre que ces régions sont énergétiquement liées. Enfin, la flexibilité de la chaîne principale de PBX (résidus 1-78) a été étudiée par des expériences de relaxation de RMN. Une série de quatre expériences de relaxation qui fournissent une mesure de libre-échange de la relaxation dipôle-dipôle transversale de 15N a été employée. Assez curieusement, les expériences montrent que l'hélice 1 est très souple sur l'échelle des picosecondes. Ceci appui le rôle proposé de stabilisation de la transition conformationnelle du désordre-à-hélice de l'extension terminale C.
Idioma: en