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El NADPH es uno de los principales productos finales de los procesos metabólicos, siendo al mismo tiempo sustrato de importantes reacciones metabólicas y de destoxificación.
Dos importantes procesos consumidores de NADPH en hígado son la síntesis de los ácidos grados y las reacciones de destoxificación.
La síntesis �de novo� de los ácidos grados es catalizada por dos sistemas enzimáticos localizados en el citoplasma: aceti-CoA-carboxilasa y ácido graso sintetasa. Los niveles de estos sistemas enzimáticos cambian en respuesta a una gran variedad de estímulos nutricionales y hormonales como, por ejemplo, el ayuno-realimentación con diera rica en hidratos de carbono o la administración de insulina (Valope y Vagelos, 1976, revisión). Se han sugerido otros factores implicados en la regulación de la síntesis de ácidos grasos. Así, la actividad de la acetil-coA-carboxilasa es afectada por varios metabolitos: -ácidos tri- y di-carboxílicos (Mat-suhashi y col., 1964; Moss y col., 1972), malonil coA (Hashimoto y Numa, 1971) y algunos metabolitos del triptófano (Hashimoto y col., 19719). Por otro lado, el complejo ácido graso sintetasa puede ser activado por varios azúcares fosforilados, siendo la fructosa 1,6-difosfato el más efectivo. Dicho metabolito revierte la inhibición por exceso de sustrato malonil-CoA (Numa y Yamashita, 1974; Wakil y col., 1983).
En relación a los procesos de destoxificación, los principales sistemas que requieren NADPH como cofactor son el sistema citocromo P-450 monooxigenasa y el sistema glutatión peroxidasa-glutatión reductasa.
El sistema P-450 monooxigenasa, de localización microsomal, consiste en una flavoproteína, NADPH-citocromo P-450 reductasa, y un número de isoenzimas citocromo P-450, algunas de las cuales han sido purificadas y caracterizadas en detalle (Lu y West, 1980; Vaxman y Walsah, 1982). Este sistema cataliza la oxidación de un gran número de compuestos y puede ser inducido por la administración de barbitúricos, hidrocarburos policiclicos aromáticos, insecticidas, etc. (Thomas y col., 1982; Klimex y col., 1982). Su función puede ser bloqueada por inhibidores selectivos, tales como 7,8-benzoflavona (Wiebel y col., 1971), metirapona (Luu-The y col., 1980), siendo el monóxido de carbono el más frecuentemente utilizado (Estabrook y col., 1963). Este sistema requiere Oxígeno molecular como cofactor, y depende también del aporte de equivalentes reducidos para su función. Estos derivan principalmente del NADPH citosólico.
La glutatión peroxidasa es una enzima que presenta una alta actividad en el hígado, que varia considerablemente bajo la influencia de diversos factores fisiológicos, incluyendo el Selenio de la dieta (Lawrence y Burk, 1976). Esta enzima cataliza la reducción de peróxido de hidrógeno hasta agua o la reducción de hidroperóxidos orgánicos a sus correspondientes alcoholes, utilizando glutatión reducido (GSH). El glutatión oxidado formado es entonces reducido por la acción de la glutatión reductasa (GR), enzima que utiliza NADPH. Ambos procesos son citoplasmáticos.
Con respecto a las vías productoras de NADPH, las cuatro reacciones principales implicadas en el suministro de este nucleótido en los organismos superiores están catalizadas por las dos deshidrogenasas del ciclo de las pentosas fosfato, la enzima málica y la isocitrato deshidrogenasa dependiente de NADP.
El ciclo de las pentosas fosfato es una vía citoplasmática alternativa de oxidación de la glucosa, que produce NADPH en dos reacciones catalizadas por las enzimas glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (D-glucosa-6-fosfato: NADP+ 1-oxidorreductasa, EC 1.1.1.49) (G6PDH) y 6-fosfogluconato deshidrogenasa (6-fosfo-D-gluconato: NADP+ 2-oxidorreductasa (descarboxilante), EC 1.1.1.40) (6OGDH).
La enzima málica (L-malato: NADP+ oxidorreductasa (oxalacetato descarboxilante), EC 1.1.1.40) (EM) fue originariamente encontrada en la fracción citoplasmática de las células hepáticas, y cataliza la descarboxilación oxidativa del malato a piruvato.
La isocitrato deshidrogenasa-NADP (treo-D-isocitrato:NADP+ oxidorreductasa (descarboxilante), EC 1.1.1.42) (IDH) cataliza la descarboxilación de isocitrato a ?-cetoglutarato, y se localiza tanto en el citoplasma como en las mitocondrias de hígado de rata.
En relación a las deshidrogenasas del ciclo de las pentosas fosfato, existen dos tipos de regulación, al igual que en el caso de cualquier otra enzima: uno a corto plazo o regulación �fina�, en el que se modifica la actividad de la proteína enzimática preexistente, y otro a largo plazo, en el que se modifica la actividad mediante cambios en la cantidad de proteína enzimática.
Respecto a la regulación a corto plazo, este tipo de de regulación se suponía existente únicamente sobre la actividad de la glucosa-6-fosfato, deshidrogenasa (G6PDH). Varios autores (Eggleston y Krebs, 1974) establecieron que el flujo a través del ciclo de las pentosas fosfato era únicamente controlado en la etapa inicial (reacción de G6PDH), ya que este paso tiene dos características especiales: 1) el producto inmediato es una lactona que es rápidamente hidrolizada a 6-fosfogluconato, y 2) la inhibición de la G6PDH por uno de sus productos: el NADPH. Estos autores encontraron que existe una completa inhibición de esta enzima cuando la razón NADPH/NADP es de aproximadamente 9. Puesto que en el citoplasma de hígado de rata la razón de nucleótidos libres es del orden de 100 (Veech y col., 1969), sería imposible que el ciclo de las pentosas fosfato operase �in vivo�. Este hecho obligó a la búsqueda de moduladores de esta actividad.
Al mismo tiempo, Sapag-Hagar (1973) sugirieron la existencia de un imbalance incompatible con el normal funcionamiento del ciclo de las pentosas fosfato, ya que la velocidad máxima de 6PGDH es menor que la de G6PDH y su sensibilidad a la inhibición por NADPH en hígado es mayor.
En la búsqueda de posibles moduladores, Eggleston y Krebs (1974) encontraron que el GSSG, a concentraciones fisiológicas, era capaz de invertir la inhibición de G6PDH por el NADPH, para lo cual era necesario un cofactor proteico presente en el hígado y otros tejidos. Sin embargo, este resultado se encuentra actualmente muy cuestionado.
González y Lagunas (1977) estudiaron también posibles moduladores de ambas enzimas. Ninguno de los estudiados tuvo ningún efecto sobre la inhibición de NADPH, y sólo la ribulosa 5-fosfato y la ribosa 5-fosfato fueron inhibidores de la 6PGDH. Sin embargo, esta inhibición pareció no tener significado fisiológico, puesto que las concentraciones fisiológicas de estos compuestos eran menores que las constantes de inhibición encontradas.
Recientemente, Fabregat y col., (1985) han propuesto que la regulación del ciclo de las pentosas fosfato no estaría producida por ningún tipo de efector alostérico, sino que ésta sería debida únicamente a variaciones en la razón NADPH/NADP. Esta razón es capaz de producir la regulación de ambas enzimas, ya que las reacciones que catalizan se encuentran fuertemente desplazadas del equilibrio en la dirección de producción de NADPH, causa por la cual esta razón fisiológicas. Las reacciones que desplazan el equilibrio son: la actuación de la lactonasa para la G6PDH y los mecanismos de eliminación del CO2 en todos los demás casos (6PGDH, EM e IDH). Esto permitiría además que todas las enzimas productoras de NADPH pudiera estar bajo un sistema de control a corto plazo por la razón NADPH/NADP. Esto ha sido demostrado para la fase oxidativa del ciclo de las pentosas fosfato en hepatocitos (Fabregat y col., 1985), adipocitos (Fabregat y col., 1986) y acinis (Revilla y col., 1986) aislados de ratas, así como para la enzima málica en adipocitos (Fabregat y col., 1986) y acinis (Revilla y col., 1986) también de ratas. Todas estas enzimas son fuertemente activadas por todos aquellos compuestos o circunstancias metabólicas que aumentan el consumo de NADPH, y son inhibidas cuando se produce una disminución de este consumo.
Con respecto a la regulación a largo plazo, que implica cambios en la cantidad de enzima, ésta es conocida desde antiguo (Fitch y Chaikoff, 1960) y tiene lugar en condiciones en que también se activan algunas vías consumidoras de NADPH. En hígado, las concentraciones de G6PDH y 6PGDH cambian drásticamente en respuesta a diferentes estímulos hormonales y nutricionales. Así, las actividades de estas dos enzimas aumentan 5-10 veces 1) cuando las ratas se alimentan con una dieta de alto contenido glucídico (Fitch y Chaikoff, 1960; Tepperman y Tepperman, 1963), 2) durante la hiperlipogénesis adaptativa, causada por la realimentación de ratas ayunadas con una dieta rica en hidratos de carbono y libre de lípidos (Tepperman y Tepperman, 1964) y 3) por acción de determinadas hormonas: insulina (Freedland y col., 1966; Rudak y col., 1971), glucocorticoides (Berdanier y col., 1976; Berdanier y Shubeck, 1979) y hormona tiroidea (Miksicek y Towle, 19829. En algunos casos se ha sido descrito que esta inducción es el resultado de un incremento en la velocidad de síntesis de las enzimas como consecuencia de un aumento en la concentración celular de sus m-RNA (Miksicek y Towle, 1982; Sun y Holten, 1978).
Otra enzima muy relacionada con las dos anteriores por su capacidad de generar NADPH, es la enzima málica. Los cambios en la actividad de esta enzima relacionados con modificaciones en la dieta han sido fundamentales para asignar a esta enzima un importante papel en la lipogénesis. Su inducibilidad por una gran variedad de estímulos hormonales y nutricionales ha sido muy estudiada (Fitch y Chaikoff, 1960; Young y col., 1964; Katsurada y col., 1983; Drake y col., 1983; Nepokroeff y col., 1974; Silpananta y Goodridge, 1971; Goodridge y col., 1984), presentando en este sentido características comunes con las deshidrogenasas del ciclo de las pentosas fosfato. En algunas de estas situaciones se ha descrito que el aumento en la actividad es consecuencia de un aumento en la síntesis de la enzima secundaria a un aumento en la concentración celular de su m-RNA (Hutchison y Holten, 1978; Goodridge y Adelman, 1976; Towle y col., 1980; Mariash y col., 1980; Magnuson y Nikodem, 1983; Jump y col., 1984). Existe, sin embargo, un número de observaciones que sugieren la participación de esta enzima en otros procesos metabólicos, aparte de la producción de NADPH para la biosíntesis de ácidos grasos. Así, se ha descrito una inducción específica de la enzima málica, sin cambios en la actividad de otras enzimas lipogénicas, cuando las ratas se alimentan con una dieta de bajo contenido proteico (Frenkel y col., 1972).
Otras de las enzimas productoras de NADPH es la isocitrato deshidrogenasa-NADP (IDH). Esta enzima, que presenta unos perfiles de desarrollo totalmente diferentes a los encontrados para las tres enzimas anteriores (Andrés y col., 19809, no sufre variación alguna en su actividad ante los cambios en la diera que afectan a la lipogénesis (Veech y col., 1969), lo que hace suponer que esta enzima no tiene el sistema de control a largo plazo.
Todos estos datos nos permiten señalar que las enzimas productoras de NADPH son reguladas a corto plazo por la razón NADPH/NADP-
En cuanto a la regulación a largo plazo, por la que se modifican los niveles de estas enzimas, ya hemos mencionado que la inducción de G6PDH, 6PGDH y EM tiene lugar, generalmente, en condiciones en las que al mismo tiempo se produce una activación de las vías consumidoras de NADPH. Teniendo en cuenta esto, podemos sugerir que las actividades de G6PDH, 6PGDH y EM podrían ser reguladas a través de un mecanismo que implicase cambios en el requerimiento de NADPH. Así, un aumento o disminución en el requerimiento de NADPH durante suficiente tiempo, produciría, respectivamente, el aumento o disminución en los niveles de G65PDH, 6PGDH y EM, independientemente de la identidad de la vía consumidora de NADPH que hubiese sido activada o inhibida.
Con el fin de elucidar el posible papel desempeñado por el requerimiento de NADPH en la regulación a largo plazo de las enzimas productoras de NADPH, hemos realizado un estudio sistemático del efecto de los cambios en el flujo a través de diferentes vías consumidoras de NADPH sobre las cantidades y actividades de las enzimas G6PDH, 6PGDH y EM.
En nuestros experimentos, la activación de las vías consumidoras de NADPH se ha llevado a cabo: a) mediante la activación de la síntesis de los ácidos grasos, en respuesta a cambios en la dieta (ayuno-realimentación) o a la administración de insulina, y b) mediante la administración de productos como t-butil hidroperóxido, Fenobarbital y Bezafibrato, los cuales son metabolizados a través de sistemas de destoxificación que consumen NADPH.
La inhibición de estas vías consumidoras se ha producido por la administración de inhibidores específicos tales como Bezafibrato, el cual produce la inhibición de la síntesis de ácidos grasos, y BCNU, un inhibidor de la GR (Frischer y Ahmad, 1977).
En estas circunstancias, hemos observado que un aumento en el consumo de NADPH conduce el aumento de la actividad específica de una o varias enzimas productoras de NADPH, y que cuando se previene este incremento en el consumo de NADPH los niveles de estas enzimas no cambian o son disminuidos.
Los resultados obtenidos corroboran nuestra anterior hipótesis, que es también confirmada por los valores de la razón NADPH/NADP encontrado en estas condiciones. |
