| Título: | Estudio integral de la trichinellosis silvestre en Extremadura |
| Autores: | Gamito Santos, José Antonio |
| Fecha: | 2011 |
| Publicador: | Dialnet (Tesis) |
| Fuente: |
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| Tipo: | text (thesis) |
| Tema: | |
| Descripción: |
Se ha realizado un estudio integral de la trichinellosis silvestre en
Extremadura. Para ello, se divide el trabajo en dos grandes bloques. Por una
parte, un estudio experimental en jabali, que es uno de los principales
hospedadores de Trichinella, no solo en Extremadura, sino en Espana e incluso
Europa y que, a la vez, se encuentra poco estudiado. Por otro lado, se ha
realizado un estudio epidemiologico de la trichinellosis en nuestra Comunidad
Autonoma, estudiando hospedadores constatados como el cerdo, el jabali y el
zorro, y posibles hospedadores como aves y mamiferos carnivoros silvestres. A
partir de los resultados obtenidos, se elabora un mapa epidemiologico de
Trichinella en Extremadura y un Plan de Lucha y Control frente a esta zoonosis. A
su vez, en el estudio experimental, se realiza el metodo micro-ELISA indirecto de
dobles anticuerpos, para observar su eficacia diagnostica comparada con la
trichinelloscopia y la digestion pepsica. Tambien, se realiza la tecnica Western Blot
como complemento al diagnostico inmunoenzimatico por ELISA y se analiza el
cuadro lesional histopatologico que producen T. spiralis y T. britovi en el jabali,
para tener un mayor conocimiento del desarrollo de la enfermedad. Por ultimo,
tambien se lleva a cabo un estudio de la distribucion muscular y carga parasitaria
en estos jabalies experimentales y se comparan esos resultados con los que se
obtienen en el diagnostico directo de los casos positivos remitidos por los
veterinarios del SES.
Para el estudio experimental, se han empleado 40 jabalies procedentes de
varias fincas de la provincia de Caceres, de ambos sexos, de una edad
comprendida entre los 2 y los 18 meses al inicio de la experiencia y de unos pesos
iniciales que oscilan entre los 3,95 kg y los 60 kg. Estos 40 jabalies se dividen en
dos experiencias infectivas. Asi, 22 animales se utilizan para una infeccion
experimental reciente y se sacrifican a los 125 DPI, y los 18 restantes son
mantenidos en experimentacion por un periodo mayor de tiempo y se sacrifican
entre los 201 y los 957 DPI. Del grupo de jabalies de infeccion reciente, cuatro
jabalies son mantenidos libres de Trichinella como animales control, mientras que
los otros 18 son divididos en dos grupos y se infectan con diferentes dosis (200,
1.000 y 20.000 L1 por animal) de Trichinella spiralis y Trichinella britovi. De cada
jabali, se obtiene suero sanguineo los dias -5, 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60,
75, 90, 105 y 125 DPI. Por su parte, en los jabalies de infeccion prolongada, dos
animales se utilizan como control y los 16 restantes son infectados con 10.000 o
20.000 L1 de T. spiralis o T. britovi, realizandose extracciones de sangre con
periodicidad mensual. Los animales se sacrifican previo aturdimiento con pistola
de bala cautiva, tras lo cual se realiza una necropsia reglada.
El nivel de infeccion de cada animal es determinado por trichinelloscopia y
digestion pepsica del diafragma. Ademas, se realiza estudio de la distribucion
muscular, analizando la carga parasitaria del diafragma, los sublinguales, los
maseteros, la paleta, los flexores-extensores toracicos, el lomo, los intercostales,
los abdominales y el jamon. Los controles son diagnosticados como negativos tras
la digestion de, al menos, 500 g de musculatura. Tras las digestiones individuales,
se evidencia la relacion entre la dosis infectante administrada y las larvas por
gramo obtenidas. Es resenable que los jabalies infectados con T. spiralis poseen
una carga parasitaria muy superior a la obtenida en los animales infectados con T.
britovi. Ademas, como musculo preferente en el tropismo larvario destaca el
diafragma, seguido de los sublinguales y el masetero. Con el menor tropismo
larvario se encuentran los intercostales. Otra generalidad observada, es una
distribucion muscular mas irregular de L1 de Trichinella en los jabalies con bajas
cargas parasitarias.
Se realiza el metodo ELISA indirecto de dobles anticuerpos, de acuerdo a
una estandarizacion previa, utilizando antigeno EBL y ES. Se incuban 100 �Êl en
placas Micro-ELISA 96 de 300 �Êl de capacidad por pocillo, durante 4 horas a 37oC,
con una concentracion antigenica de 3 �Êg/ml. Las muestras de suero son
utilizadas a una dilucion 1/1.000 y el conjugado anti-pig IgG a una dilucion de
1/25.000. Como sustrato se utiliza TMB al 0,01% y H2O2 (3 �Êg/ml) en tampon
citrato, frenandose la reaccion a los 8-10 minutos con H2SO4 3N (50 �Êl por
pocillo). La densidad optica obtenida a 450 nm es transformada en porcentaje de
reactividad con respecto a los sueros control positivo y negativo de cada placa con
el objetivo de reducir la variacion entre placas.
Los valores diagnosticos para cada antigeno, son establecidos en base a los
limites de confianza del 90% y 99% de 1.844 sueros de jabalies procedentes de
monterias de toda la region extremena, negativos a Trichinella spp. por digestion
artificial de, al menos, 25 g de pilares de diafragma, determinandose asi tres
categorias de resultados: animales negativos, dudosos y positivos.
En los jabalies de infeccion reciente se observa que, ya en el 10 DPI, se
produce un ligero aumento en el porcentaje de reactividad en algunos animales y
con algunos antigenos; aunque los primeros incrementos significativos se
evidencian entre los 15-20 DPI. Cuando la parasitacion muscular resulta muy
escasa (en lotes infectados con 200 L1), se aprecia un retraso en el comienzo de
la produccion de anticuerpos. En estas bajas parasitaciones, la mayor respuesta
se obtiene sobre el 40-50 DPI en los jabalies parasitados por T. britovi y sobre el
90-125 DPI en los parasitados por T. spiralis. En los jabalies con cargas
parasitarias altas (infectados con dosis de 20.000 L1), las maximas respuestas de
anticuerpos coinciden en el tiempo con los jabalies infectados con bajas cargas
(200 L1) pero el porcentaje de reactividad es mayor en los primeros, obteniendose
en ciertas ocasiones el 120% de reactividad. Atendiendo a la evolucion humoral de
las dos especies de Trichinella estudiadas, se puede observar un diferente patron
cinetico, de manera que en los jabalies infectados con T. britovi, se obtiene un
maximo de respuesta humoral sobre el 30-50 DPI y posteriormente esta respuesta
desciende, mientras que en los infectados con T. spiralis la respuesta es mas
lenta, aumentando paulatinamente hasta el dia de sacrificio.
En los jabalies de infeccion prolongada, se observa que la persistencia de
anticuerpos a DPI tan avanzados esta muy influenciada por la propia idiosincrasia
de cada jabali, detectandose anticuerpos en jabalies que han conseguido calcificar
las larvas musculares y, por el contrario, perdiendose la respuesta frente a
parasitaciones que todavia presentan larvas viables en la musculatura. En estos
jabalies, se ha realizado un ELISA, utilizando mezcla de antigenos de ambas
especies de Trichinella, observandose que no se obtiene una mejora sustancial en
el diagnostico, ya que los falsos negativos siguen sin ser correctamente
diagnosticados.
La existencia de leves parasitaciones por protozoos (Balantidium coli y
Sarcocystis miescheriana), acantocefalos (Macracanthorhynchus hirudinaceus) y
nematodos (Metastrongylus spp., Strongylida spp., Ascarops strongylina y
Oesophagostomum dentatum) no producen reacciones cruzadas con Trichinella
evidenciables capaces de alterar el resultado negativo de la tecnica ELISA.
El Western Blot se ha realizado sobre los jabalies 23, 25, 30, 32, 34, 36, 37 y
Control E, utilizando tanto antigeno EBL como ES. Ademas, se analizan por WB
jabalies abatidos en monterias que dan un resultado negativo por digestion
artificial pero que tienen reactividad alta por ELISA. La cantidad de antigeno que
se emplea es de 1.000 �Êg para SDS-PAGE de antigeno EBL y 600 �Êg para SDSPAGE
de antigeno ES. Este antigeno es diluido 1:4 con Sample buffer. Las
muestras de suero son utilizadas a una dilucion de 1:8 en TBS-Tw20 caseina 3% y
el conjugado anti-pig IgG a una dilucion de 1/500 en TBS-Tw20 caseina 3%.
Como sustrato se utiliza Cloronaftol y H2O2 en una solucion de metanol y TBS,
frenandose la reaccion mediante aclarados en agua destilada.
Tras la realizacion del Western Blot, se aprecia una analogia evidente con la
evolucion humoral evidenciada al realizar la tecnica ELISA en todos los jabalies, lo
que demuestra la fiabilidad de los resultados obtenidos en ambas tecnicas.
Aunque en el WB no existe un patron de reconocimiento homogeneo, destacan
una serie de bandas aparentemente homologas al grupo de bandas referenciadas
por otros autores como TSL-1. Para el Ag EBL T1, los pesos moleculares
aparentes detectados en estas bandas han sido aproximadamente 75, 72, 62, 52 y
47 kDa. Por su parte, utilizando Ag EBL T3, para estas bandas destacadas se
calculan unos pesos moleculares aparentes de 70, 60, 49, 45 y 42 kDa. Dada la
precision de la curva patron, es posible que ambos grupos de bandas sean en
parte homologos y las diferencias de escasos kDa sean mas aparentes que reales
en algunos casos. Aparte de este bandeo destacado que aparece en todos los
jabalies, se observan diferentes bandas de evolucion heterogenea. La utilizacion
de Ag ES, revela un patron de reconocimiento antigenico menos numeroso, ya
que, al 125 DPI, en la mayoria de los jabalies, se detecta este grupo de bandas de
peso molecular medio. Los sueros de jabalies abatidos en monterias con una alta
reactividad en la tecnica ELISA, pero negativos a la digestion de 25 g de tejido
muscular, reaccionan frente a diversas bandas antigenicas por WB, en muchos
casos con un patron comparable al observado en los jabalies de infeccion
experimental, sugiriendo que podrian presentar una respuesta especifica frente a
Trichinella a pesar de que la infeccion no es demostrable por metodos directos. De
manera general, el bandeo obtenido en la mayoria de los jabalies abatidos en
monterias, tiene bandas en comun con el patron antigenico observado en algunos
jabalies experimentales.
Por su parte, el estudio histopatologico revela el cuadro lesional derivado de
la parasitacion por Trichinella en jabali, observandose principalmente alteracion a
nivel de musculatura esqueletica. Asi, de manera general, el cuadro lesional en los
diferentes organos de estudio (corazon, higado, pulmon, rinon, bazo, linfonodo e
intestino delgado) es ligeramente mayor en los jabalies infectados por T. spiralis. A
nivel muscular (diafragma), el infiltrado celular perilarvario esta formado
principalmente por linfocitos y celulas plasmaticas, siendo ligeramente mayor
alrededor de las larvas de T. britovi, aspecto que conduce a la presencia de
calcificaciones larvarias en algunos jabalies. De manera general, la respuesta
celular disminuye con el paso del tiempo.
El estudio epidemiologico se ha realizado sobre diferentes hospedadores
en el periodo 2001/2010. Asi, una parte importante de este bloque de estudio ha
sido la recepcion y busqueda del parasito en zorros. En ellos, se ha detectado una
prevalencia del 2,86%. Como musculos de diagnostico se ha utilizado
principalmente flexoresextensores toracicos y se ha digerido una media de 25 g
por animal. En estos animales se observa la presencia de T. britovi en mayor
proporcion que la detectada en cerdos o jabalies, por lo que constituye su
reservorio natural, no obstante, la presencia de T. spiralis en zorros va
aumentando ocupando poco a poco el lugar de T. britovi.
En el estudio de campo, tambien se ha realizado una busqueda del parasito
en otros carnivoros y en aves. Estas muestras se han remitido desde el Centro de
Recuperacion de Fauna Silvestre �gLos Hornos�h de Sierra de Fuentes,
detectandose una garduna (Martes foina) positiva a T. britovi con una parasitacion
de 2,72 LPG en miembro toracico y un carabo comun (Strix aluco) con una
parasitacion de 0,898 LPG en musculo pectoral, en el que no se ha podido
identificar la especie de Trichinella involucrada. Por ello, las prevalencias
detectadas han sido del 2,63% en mamiferos silvestres (excluyendose el zorro) y
del 0,14% en aves.
Ademas, se han muestreado jabalies abatidos en monterias, detectandose
un total de 13 casos positivos de 3.055 jabalies analizados (0,43%),
determinandose que del 76,92% de los casos se aisla T. spiralis. Para obtener
unos datos mas completos de los casos positivos a Trichinella en Extremadura, se
nos remite desde el Servicio Extremeno de Salud todos los casos positivos
detectados por los veterinarios oficiales. Asi, sabiendo los jabalies abatidos y los
cerdos sacrificados en los diez anos de estudio, se puede establecer una
prevalencia del 0,18% en jabali, del 0,0047% en cerdos de matanza domiciliaria y
del 0,00011% en cerdos de matadero. En los dos hospedadores, la especie de
Trichinella mas presente es T. spiralis, las cargas parasitarias mas habituales son
las de 1-10 LPG y los musculos mas parasitados son el diafragma, el sublingual y
el masetero, siendo interesante la importancia de la carga parasitaria detectada en
jamon, paleta y lomo de estos jabalies de infeccion natural, y la distribucion mas
irregular en los casos de bajas cargas parasitarias. Solo se han observado
infecciones mixtas (T1+T3) en jabalies (2,3%). La tendencia observada en las
especies de Trichinella implicadas conlleva un aumento de los aislados de T.
spiralis en relacion a T. britovi, quedando esta ultima muy ligada a zonas de
marcado caracter montanoso y silvestre. Se han observado como zonas de mayor
prevalencia de la trichinellosis, las comarcas del Valle del Jerte, Sierra de Gata y
La Vera, y las comarcas con mayor casuistica Las Villuercas, Los Ibores y
Monfrague. En todas estas comarcas, el Plan de Lucha y Control disenado debe
ser muy estricto. Este Plan de Lucha y Control conlleva una serie de actuaciones
por parte del consumidor final de carne de cerdo y/o jabali, cazadores, gestores
cinegeticos, ganaderos, veterinarios, administraciones publicas e investigadores.
Como objetivo de dicho Plan, subyace la necesidad de una convivencia con el
parasito bajo unos niveles de control que impliquen seguridad alimentaria. In this research work a comprehensive analysis of wild trichinellosis in Extremadura (Spain) has been carried out. This study can be divided into two large blocks. The first part is constituted by an experimental assay in wild boar, one of the main hosts of Trichinella (not only in Extremadura, but also Spain and even Europe) but still poorly studied in the context of this disease. The second part of this work is composed by an epidemiological study of trichinellosis in our region, that analyzes not only usual (pig, wild boar and fox) but also other potential hosts (birds and wild mammalian carnivores), and which has allowed to perform an epidemiological map of Trichinella in Extremadura and a Combat and Control Plan against this zoonosis. The indirect double-antibody micro-ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) technique has been tested as diagnosis tool for the disease, and its efficacy has been compared to trichinelloscopy and artificial digestion. Western Blot technique has been also conducted as complementary diagnosis technique, as well as histopathological lesions produced by T. spiralis and T. britovi in wild boar. These data allow extending the knowledge for the understanding of the pathogenesis of trichinellosis. Finally, the muscle distribution and parasite load in experimental wild boars have been analyzed, comparing these results with those obtained in the direct diagnosis of positive cases referred by Public Health veterinarians. For experimental study, 40 males and females wild boars from several hunting reserves of Caceres province were employed. Animals were between 2 and 18 months old at the beginning of the experiment; their initial weights ranged from 3.95 kg to 60 kg. These 40 wild boars were grouped into two experimental assays: 22 animals were used for a short experimental infection (euthanized at 125 DPI); and the remaining 18 animals were maintained for a longer infection period and euthanized between 201 and 957 DPI. In the first group (short infection period) four animals were selected as controls free from Trichinella; the remaining 18 animals were divided into two lots and infected with different doses (200, 1,000 and 20,000 L1 per animal) of T. spiralis and T britovi. Blood serum samples were obtained on -5, 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 105 and 125 DPI from each wild boar. In the second group (prolonged infection) two animals were used as controls and the remaining 16 were infected with 10,000 or 20,000 L1 of T. spiralis or T. britovi; blood samples were taken monthly. All animals were euthanized using a captive gun bolt before a complete necropsy was carried out. Parasite infection was determined by trichinelloscopy and artificial digestion in diaphragm muscle samples of each animal. A larvae distribution study was also carried out in diaphragm, tongue base, masseter, upper forelimb, lower forelimb, intercostals, abdomen and upper hindlimb muscles. Control animals were confirmed as negative after digestion of at least 500 g of muscle. A relationship between administered infecting dose and infective larvae per gram obtained could be observed. Wild boars infected with T. spiralis presented higher parasite load than those animals infected with T. britovi. Furthermore, highest larvae densities were found in the diaphragm followed by sublingual and masseter muscles. The lowest larval tropism was observed in the intercostals. More irregular muscle distribution was reported in animals with low parasite loads. An indirect double-antibody micro-ELISA method was used in order to detect circulating anti EBL and ES antibodies in wild boars sera. 96 well Micro-ELISA flat botommed polystyrene plates of 300 �Êl capacity were used. 100 �Êl of 3 �Êg/ml antigen were placed per well and then were incubated at 37oC for 4 hours. Serum was diluted 1/1,000 and conjugate (anti-pig IgG) was diluted 1/25,000. Finally, substrate was added (0.01% TMB in a citrate buffer, also adding 3 �Êl/ml of H2O2). Reaction was stopped at 8- 10 minutes by applying 50 �Êl of H2SO4 3N per well. Optical density obtained in spectrophotometer (450nm) was expressed in percentage of reactivity respect to the positive and negative control in each plate, in order to reduce the variability between the results from different assays. The 90% and 99% confidence limits or �gcut-off�h for each antigen were established employing the results of 1,844 Trichinella spp. negative (by artificial digestion of at least 25 grams of diaphragm) wild boars from Extremadura region hunts, considering three different categories: negative, doubtful and positive. In the first group of experimentally-challenged wild boars (with short infection period) a slight increase in the percentage of reactivity against some antigens could be observed in several animals at 10 DPI, although the first significant increases are evident around day 15-20 PI. In animals infected with 200 L1, in which the muscle parasitism was very low, a delayed antibody production could be observed, with a peak about 40-50 DPI for animals infected with T. britovi and about 90-125 DPI for those infected with T. spiralis. The peak of antibody response could be observed at the same time in both animals with high parasite loads (infected with 20,000 L1 doses) an in those infected with low parasite loads (200 L1), but the percentage of reactivity was higher in the first ones, with 120% observed in some cases. Two different types of kinetics depending on Trichinella species used for challenge could be noticed the wild boar. Thus, in animals infected with T. britovi, a clear peak in the production of antibodies around day 30-50 PI was observed, decreasing later until the end of experiment. In contrast, wild boars infected with T. spiralis presented a constant antibody increase from the first week postinfection until the end of the study. In wild boars with prolonged infection period, the persistence of antibodies in the last days of the experiment is strongly correlated with the individual characteristics of each animal. Thus, antibodies could be detected in animals with calcified larvae, and in the other hand absent humoral response was observed in wild boars that still had viable larvae in the musculature. In these wild boars a mixed antigen using two species of Trichinella was employed in ELISA technique with the purpose of improving in the diagnosis, but false negatives were not properly detected even with the use this antigenic combination. The presence of infection by protozoa (Balantidium coli and Sarcocystis miescheriana), acanthocephala (Macracanthorhynchus hirudinaceus) and nematodes (Metastrongylus spp., Strongylida spp., Ascarops strongylina and Oesophagostomum dentatum) did not affect the final result of the ELISA technique, so no cross reactivity was found. Western Blot was performed using the serum of animals identified as 23, 25, 30, 32, 34, 36, 37 and Control E, employing both crude and excretory-secretory antigens. Besides, some samples of hunted wild boars that presented a negative result by artificial digestion but high reactivity by ELISA were also analyzed by Western Blot technique. 1,000 �Êg of EBL antigen or 600 �Êg of ES antigen for SDS-PAGE were used. Antigens were diluted 1:4 with Sample buffer. Serum samples were diluted 1:8 in TBS-Tw20 3% casein. Anti-pig IgG conjugate was diluted 1/500 in TBS-Tw20 3% casein. Cloronaftol + H2O2 were used as substrate in a solution of methanol and TBS. The reaction was finnally stopped by washing with distilled water. It could be appreciated an evident analogy between this method and the humoral evolution observed in all wild boars by ELISA. This fact demonstrates the reliability of the results obtained by both techniques. Although the there is not a uniform pattern recognition in WB, it could be highlighted a series of bands apparently homologous to the group of bands referenced by other authors as TSL-1 For the Ag EBL T1, apparent molecular weights detected in these bands have been approximately 75, 72, 62, 52 and 47 kDa. On the other hand, apparent molecular weights of 70, 60, 49, 45 and 42 kDa were calculated for these bands by using EBL Ag T3. Given the accuracy of the calibration curve, it is possible that both groups of bands were partially homologous, and the low kDa differences observed were more apparent than real in some cases. Apart from this prominent banding that appears in all wild boars, there were also different bands of heterogeneous development. The use of Ag ES reveals a pattern of lower antigen recognition. At 125 DPI, this group of medium molecular weight bands was detected in most wild boars. Sera from hunted wild boars with high reactivity by ELISA, but negative by 25 g of muscle tissue artificial digestion, reacted against different antigenic bands by WB. The pattern observed in many cases was comparable to that observed in experimentally infected wild boars, suggesting that they may provide a specific response against Trichinella although infection is not detectable by direct methods. In general, the banding obtained in most hunted wild boards had common bands with the antigenic pattern observed in some experimentally infected animals. Histopathological study revealed the lesions derived from Trichinella infection in wild boar. The alterations were mainly observed in skeletal muscle; in the other organs studied (heart, liver, lung, kidney, spleen, lymph node and intestine) they were slightly higher in wild boars infected with T. spiralis. In muscle (diaphragm), inflammatory infiltrates (lymphocytes and plasma cells) were observed around the larvae. This infiltrate is slightly higher around T. britovi, causing the presence of calcifications in these wild boars. In general, cellular response tended to decrease over time. The epidemiological study has been performed on different hosts during 2001- 2010 period. An important part of this study was the searching of Trichinella parasite in foxes. A prevalence of 2.86% in these animals has been detected. For diagnosis purpose, lower forelimb muscles were used, and an average of 25 g per animal was digested. The presence of T. britovi in foxes is higher than in pigs or wild boars, so they are natural reservoir of T. britovi. However, the presence of T. spiralis in this host is increasing and replacing T. britovi. The presence of Trichinella in other carnivores and birds has also been studied. Samples proceeded from "Los Hornos" wildlife recovery center (Sierra de Fuentes, Caceres, Spain). A T. britovi positive stone marten (Martes foina) with 2.72 LPG parasite load in forelimb, and also a tawny owl (Strix aluco) infected with unidentified Trichinella (with a parasite load of 0.898 LPG in pectoral muscle) could be found. Therefore prevalences of 2.63% in wild mammals (excluding the fox) and 0.14% in birds have been detected. In hunted wild boars, 13 positives cases (0.43% of the 3,055 animals tested) were found; T. spiralis was isolated in 76.92% of these cases. Data from all positive cases detected by Regional Health Service official veterinarians had also been taken into account for the establishment of 0.18% prevalence in wild boar, 0.0047% in domestic pigs sacrificed at home and 0.00011% in industrial pigs. T. spiralis was more present in both hosts, being the most common parasite loads between 1 and 10 LPG. Muscles with more larval tropism were the diaphragm, sublingual and masseter. In naturally-infected wild boars high larval tropism in upper hindlimb, upper forelimb and back was detected, being the muscular distribution more irregular in cases with low parasite load. Mixed infections (T1+T3) were only found in wild boars (2.3%). There was an increase of T. spiralis compared to T. britovi, which has been mainly isolated in mountain areas. Most prevalent zones were Valle del Jerte, Sierra de Gata and La Vera, and the higher casuistics were found in Las Villuercas, Los Ibores and Monfrague regions. In all these areas the Combat and Control Plan for this disease must be very strict, involving pork/wild boar final consumers, hunters, hunting managers, farmers, veterinarians, government and researchers. The objective of this plan is the coexistence with the parasite under control levels to ensure food safety. |
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