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En 1983, en las islas Azores, se produjo un pequeño incendio en un invernadero en el que se cultivaba piñas. En lugar de dañar las plantas, el humo causó en ellas una repentina floración. Este sorprendente hecho es hoy fácilmente explicable: las llamas producen etileno, una hormona vegetal que además de inducir la floración juega un papel protagonista en el crecimiento y desarrollo vegetal.
Que las plantas producen y utilizan su propio etileno quedó firmemente establecido en los albores del presente siglo, aunque los detalles moleculares de cómo las plantas sintetizan esta fitohormona ha empezado a esclarecerse en las tres últimas décadas. Investigadores que han estudiado la bioquímica y fisiología del etileno durante muchos años se sorprenden aún de la diversidad de efectos que este compuesto provoca en las plantas. El etileno causa la germinación de las semillas, la apertura de las flores, que los frutos maduren y caigan y que las hojas y pétalos se marchiten y vuelvan pardos.
La industria agrícola utiliza etileno exógeno para que la maduración se uniforme, haciendo la recolección más eficiente. Esta situación sería aún más eficiente si consiguiéramos controlar la generación de etileno por las plantas. Del mismo modo, cabe pensar, que si pudiéramos inhibir la biosíntesis de etileno de forma efectiva, se mantendría la vitalidad de las plantas durante más tiempo, incrementándose el rendimiento de las cosechas. La clave para conseguir estas metas se basa en un profundo conocimiento del mecanismo de biosíntesis del etileno.
Este conocimiento recibió un gran impulso, cuando en 1979, Adams y Yang y Lürssen y cols. descubrieron simultáneamente que las plantas sintetizan etileno a partir del ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico (ACC). Este aminoácido inusual se produce a partir de S-adenosil-metionina, un eslabón común a diversas rutas metabólicas, que resulta de la unión del grupo adenosil al aminoácido común metionina. Con este descubrimiento quedó finalmente establecida la ruta biosintética el etileno en plantas superiores.
Conocida la ruta y la mayor parte de los detalles del mecanismo de biosíntesis del etileno, la atención se centró en contestar numerosas cuestiones pendientes respecto de la bioquímica del etileno en las plantas, como son: ¿Cuál es la naturaleza el enzima formador de etileno? ¿Cómo regulan las plantas su biosíntesis? ¿Cómo puede inhibirse el proceso? Ó ¿Cómo interacciona el etileno con el sitio receptor en las plantas para ejercer sus diversos efectos?
La conversión de ACC en etileno es un paso enzimático. Sin embargo, a pesar del gran número de ensayos realizados, el enzima ha eludido durante muchos años todo intento de aislamiento y caracterización. El enzima parece estar asociado con las membranas celulares, ya que la actividad se pierde completamente cuando el tejido se homogeneiza. Por otro lado, se han descrito varios sistemas enzimáticos oxidativos capaces de transformar ACC en etileno, entre ellos el que describieron en 1981 Vioque y cols. Sin embargo, estos sistemas enzimáticos aportaron pistas falsas, pues hoy día se conoce que en ellos el etileno se generaba por reacciones no enzimáticas entre el ACC y radicales libres que resultan de diversas reacciones enzimáticas no correspondiéndose con el sistema que opera fisiológicamente. Estos desafortunados hechos, han entorpecido la labor de los investigadores, quienes entre los años 80 y 90 han conseguido pocos avances en la caracterización del enzima formador de etileno (EFE).
En 1990 Hamilton y cols. identificaron un gen en tomate que codificaba el EFE o, al menos, un polipéptido componente de éste. La secuencia aminoácida de este polipéptido tiene una estrecha homología con la de flavona-3-hidroxilasa, un enzima soluble que participa en la ruta biosintética de las antocianidinas. Ningún bioquímico había propuesto previamente afinidad entre estos dos enzimas. La relación estructural deducida de la homología secuencial ha suministrado la pista clave que ha permitido salir del impase alcanzado con el EFE. Para la estabilización de flavonona-3-hidroxilasa se requiere Fe2+ y ascorbato. Cuando estas condiciones se utilizaron para extraer el enzima de fruto de melón, se consiguió por ver primera recuperar auténtica actividad EFE como enzima soluble.
El caso del EFE ha sido calificado por Kende (1993) como un �típico caso de bioquímica reversa�, en donde el aislamiento de un gen por parte de biólogos moleculares ha permitido aislar y caracterizar un enzima que ofrecía dificultades por técnicas bioquímicas convencionales.
A raíz de este hallazgo, el estudio de EFE, hoy denominado ACC oxidasa, ha entrado en una nueva etapa en la que todo el cuerpo de evidencias acumuladas durante una década ha de ser revisado con el enzima in vitro. Por ello, en esta Tesis, se ha planteado como objetivo extraer y determinar las características bioquímicas y moleculares del enzima ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico oxidasa. Como material vegetal se ha utilizado para Blanquilla, un fruto climatérico caracterizado por una alta tasa de producción de etileno.
Dentro de este objetivo general, en la presente Memoria, se abordan los siguientes aspectos concretos:
1. Obtención de extractos enzimáticos de pericarpio de pera con actividad ACC oxidasa.
2. Optimización del ensayo de actividad in vivo e in vitro.
3. Determinación de las características cinéticas y moleculares del enzima.
4. Estudio de la inactivación de ACC oxidasa durante la catálisis.
5. Inducción de la actividad del enzima por etileno y,
6. Estudio de la evolución de la actividad ACC oxidasa a lo largo del desarrollo, conservación y maduración del fruto.
El fin primordial de esta Tesis se integra plenamente dentro de los objetivos de los Proyectos de Investigación ALI91-0421 y ALI94-0738 (CICYT) que estudian los mecanismos reguladores de la maduración de los frutos, y entronca con la línea investigadora tradicional del Departamento de Fisiología y Tecnología de Productos Vegetales del Instituto de la Grasa. |
